Compartició d'articles丨Una plataforma microfluídica-CRISPR-Cas14a millorada amb IA-per a una detecció precisa-de geminivirus en plantes de tomàquet i mosques blanques

Els geminivirus suposen una greu amenaça per a la producció mundial de tomàquet a través de la ràpida evolució i la transmissió mundial per la mosca blanca. Els mètodes de detecció actuals es dirigeixen principalment a les plantes simptomàtiques, sovint només ofereixen resultats de diagnòstic després que les càrregues virals hagin assolit nivells transmissibles, cosa que fa que el control de malalties sigui ineficaç. La intervenció primerenca depèn d'identificar les infeccions abans de l'aparició dels símptomes-o fins i tot de detectar la presència viral en els insectes vectors abans que transmetin virus a les plantes. Tot i que els avenços recents en l'amplificació isotèrmica i el diagnòstic basat en CRISPR-ofereixen solucions potencials, la implementació pràctica s'enfronta a limitacions inherents: incompatibilitat entre l'amplificació enzimàtica i els sistemes CRISPR, riscos de contaminació dels procediments de diversos passos i adaptabilitat de camp inadequada dels dispositius de detecció. Per abordar aquests reptes, hem desenvolupat MaC14a-una plataforma microfluídica millorada amb IA-que integra l'amplificació ràpida isotèrmica multienzim asimètrica (aMIRA) amb CRISPR-Cas14a. Aquest sistema supera les barreres tècniques clau optimitzant l'estequiometria d'imprimació per generar ssDNA per a l'activació de Cas14a independent de PAM-, aconseguint una detecció ultrasensible (10 fM) alhora que elimina la contaminació-creuada mitjançant reaccions d'un sol-tub. Combinat amb un xip microfluídic centrífug, detecció òptica portàtil i interpretació del senyal-basada en aprenentatge automàtic, MaC14a permet la detecció multiplexada de quatre geminivirus en 5 minuts, demostrant una precisió diagnòstica del 100% tant per a mostres de plantes com de mosca blanca. Els seus avenços inclouen: (i) la detecció presimptomàtica d'infeccions a les plantes i (ii) la determinació precisa del transport viral en mosques blanques individuals-omplint un buit tecnològic crític en la vigilància prèvia a la-transmissió. Més enllà d'oferir una eina nova per a la gestió de geminivirus, aquest estudi estableix un paradigma d'"AI-CRISPR-microfluídica" per a la protecció dels cultius. En canviar l'atenció de les plantes simptomàtiques a vectors virulífers i infeccions asimptomàtiques, aquesta tecnologia ofereix una solució transformadora per interrompre els cicles de transmissió viral a la seva font.

Flux de treball integrat del sistema MaC14a per a la vigilància multiplex de geminivirus.

(A) Mecanisme de detecció d'àcid nucleic mediada per aMIRA-Cas14a-. Esquema que il·lustra l'amplificació de l'ssDNA impulsada per aMIRA-acoblada amb el reconeixement de l'ssDNA independent de PAM de Cas14a i l'activitat col·lateral d'escissió, que permet la detecció d'un-tub únic (compatible amb instruments de PCR fluorescents{-en temps real) o en-l'anàlisi centrífuga{9} de desenvolupament de microflupèdes en lloc dispositius). (B) Flux de treball de detecció microfluídica (MaC14a) per a diagnòstics desplegables de camp-. Els passos de temps s'indiquen amb fletxes, que mostren la durada de cada procés dins de l'analitzador portàtil. (C) Diagrama de flux de l'algorisme de detecció-en temps real basat en xarxes de memòria a llarg-term termini (LSTM). L'algoritme optimitzat facilita el processament-en temps real dels senyals de fluorescència, permetent la interpretació dels resultats en 5-10 minuts.

El sistema de detecció aMIRA-Cas14a

(A) El diagrama esquemàtic il·lustra el mecanisme de reacció de la plataforma de detecció aMIRA-Cas14a. (B) L'activitat específica d'escissió de Cas14a en productes aMIRA es va verificar mitjançant l'anàlisi d'electroforesi en gel (C) Anàlisi comparativa dels mètodes de detecció de Cas14a d'un -pas i de dos-pasos-. Nota: En el protocol de reacció de dos-passos, el procés comença amb una amplificació aMIR de 20-minuts, seguida de l'addició del sistema de detecció Cas14a per al control de la fluorescència. En conseqüència, la recollida de senyals de fluorescència s'inicia al moment dels 20 minuts. (D) i (E) Es van realitzar experiments d'optimització per determinar les proporcions òptimes d'imprimació directa i inversa. (F-I) L'especificitat del sistema aMIRA-Cas14a es va validar mitjançant la detecció de quatre dianes virals diferents (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV i TbCSV) en mostres de plantes. La mostra mixta (designada com a Mix) es va preparar combinant volums iguals de cada preparació d'ADN viral.

Per aconseguir l'amplificació del senyal per a traces d'àcids nucleics virals i proporcionar suficients substrats per a Cas14a, hem desenvolupat aMIRA (amplificació ràpida isotèrmica multienzim asimètrica) basada en MIRA. El sistema aMIRA-Cas14a resultant ofereix els següents avantatges clau:

1. L'estequiometria d'imprimació optimitzada permet que MIRA sobreprodueixi preferentment ssDNA, que serveix com a substrat directe per a Cas14a. Mitjançant l'ajust de la proporció d'encebador cap endavant-{-invertida a 20:1, el sistema genera suficient ssDNA per activar l'activitat d'escissió independent de PAM-de Cas14a, que reconeix i escinda específicament l'ssDNA.
2. La integració única de MIRA i CRISPR-Cas14a elimina els riscos de contaminació creuada.
3. MIRA millora significativament la sensibilitat de detecció, permetent la detecció d'àcids nucleics virals d'abundància ultra baixa.
4. aMIRA-Cas14a manté una alta especificitat, evitant els falsos positius causats per l'amplificació no específica.

En definitiva, la integració única de MIRA i CRISPR-Cas14a elimina els riscos de contaminació i aconsegueix una sinergia perfecta entre els punts forts de MIRA i el sistema CRISPR-Cas14a. Això resol el repte de la incompatibilitat entre l'amplificació isotèrmica i els sistemes CRISPR, que representa l'avenç tecnològic bàsic de la plataforma MaC14a. El sistema aMIRA-Cas14a aconsegueix una millora de 1.000 vegades en la sensibilitat alhora que garanteix una amplificació específica. Combinat amb el reconeixement específic de la seqüència de Cas14a, això proporciona una validació de l'especificitat de doble capa, sense reactivitat creuada contra virus no objectiu o mostres sanes-abordant un altre problema de la indústria: la tendència als falsos positius.

Els reactius d'amplificació ràpida isotèrmica multienzim MIRA utilitzats en aquest estudi van ser proporcionats per Amp-Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Més enllà d'un excel·lent rendiment dels reactius, Amp-future Biotech també ofereix un equip de suport tècnic professional i de resposta ràpida.

MIRA demostra una gran compatibilitat amb els xips microfluídics basats en centrifuga-desenvolupats per a aplicacions d'investigació i diagnòstic:

1.Sistema de reacció miniaturitzat, adequat per a les cambres de reacció de micro-volum característiques dels xips microfluídics;
2. Capacitat de detecció múltiplex en una sola carrera;
3.Compatibilitat amb dispositius portàtils, fluxos de treball suaus des de la mostra fins al resultat.

L'analitzador portàtil i l'arquitectura de xip.

(A) Vista explosiva del dispositiu de detecció portàtil, que mostra els components principals. (B) Arquitectura modular del xip microfluídic centrífug. (C) Control fluídic impulsat per centrifugació. Anàlisi de trajectòries de transport de líquids sota forces centrífugues programables.

hem dissenyat un dispositiu portàtil integrat de "mostra-entrada, resposta-sortida" del punt-de-proves de cura (POCT) optimitzat per al desplegament de camp, tal com es mostra a la figura. 4A. El prototip compacte (23 cm (L) × 21 cm (W) × 14 cm (H), 12,5 kg de massa total) aconsegueix una portabilitat excepcional. Els components bàsics del sistema inclouen un servomotor d'alta-precisió per a un control de rotació precís i una unitat de calefacció d'aire per a la regulació de la temperatura. Un mòdul de detecció òptica integrat, situat a sota del xip, facilita l'excitació i la mesura de la fluorescència, assegurant una gran sensibilitat i precisió en la detecció. El dispositiu portàtil està equipat amb un sistema operatiu Android integrat, que ofereix una interfície-de fàcil ús on els operadors poden seleccionar fitxers d'operacions preprogramats que contenen paràmetres detallats com ara el temps de reacció i la temperatura. Els resultats i les conclusions es mostren en-temps real en una pantalla LCD, la qual cosa permet una ràpida adquisició d'informació. A més, el sistema incorpora un mòdul de comunicació sense fil que admet la transmissió de dades-en temps real a dispositius mòbils o servidors al núvol, integrant-se amb algorismes d'intel·ligència artificial per a la interpretació i anàlisi immediata dels resultats de les proves.

news-800-847

Per avaluar la capacitat del sistema MaC14a per detectar el transport viral en vectors d'insectes, vam realitzar assajos d'adquisició de TYLCV mitjançant

Poblacions de Bemisia tabaci. A les mosques blanques se'ls va permetre un període d'alimentació de 3-dies a les plantes infectades amb TYLCV i després es van processar a través del

Sistema MaC14a (Fig. D). L'anàlisi posterior va revelar que 8 de cada 10 mosques blanques provades (80%) presentaven senyals virals positius (Fig. E). És important destacar que tots els exemplars de la cohort de control negatiu (alimentats exclusivament amb plantes sanes) van mantenir els nivells de fluorescència de referència. Aquests resultats demostren que el sistema MaC14a pot identificar amb precisió el virus per a la monitorització de la mosca blanca i ressaltar el seu potencial a nivell individual. Control de la transmissió viral en entorns agrícoles.

En un experiment de validació a doble-cec posterior, vam provar 20 mostres de fulles de tomàquet (S1-S20) recollides de dues zones de cultiu d'hivernacle a Hangzhou, província de Zhejiang, Xina, i dos d'hivernacle.zones de cultiu a Nanning, província de Guangxi, Xina. Cada zonava proporcionar cinc mostres de fulles de tomàquet que presentaven símptomes típics de virusinfecció (com ara clorosi, moteig de mosaic i ondulació de fulles) i cincmosques blanques (20 en total). El sistema MaC14a millorat amb IA-s'ha lliurat reresultats al minut 5, que eren totalment coherents amb els obtingutsd'un assaig aMIRA-Cas14a de 60-min i una plataforma qPCR, demostrant100 % d'acord (Figs. F, S6-S7, Taula S3). A més, el virusles espècies detectades a les mostres de plantes eren molt coherents amb aquestesidentificats en els insectes vectors de la mateixa zona de cultiu. Aquestsels resultats posen de manifest l'important potencial del MaC14a-millorat amb IA-diagnòstic de virus de plantes del lloc, aconseguint alta velocitat (a partir de l'àcid nucleicextracció per a la lectura del resultat en només 10 minuts), alta precisió (coherentamb resultats de qPCR) i portabilitat.