Les tecnologies de diagnòstic molecular avui evolucionen a un ritme sense precedents, amb avenços importants durant els darrers dos anys. Entre elles, les tecnologies d’amplificació isotèrmica han guanyat més atenció a causa de la seva capacitat d’amplificar sense necessitat d’equips especialitzats. Existeixen diversos mètodes d’amplificació isotèrmica coneguts, com ara LAMP, RPA i RAA. Tot i això, avui vull introduir una tecnologia d’amplificació isotèrmica més recent-MIRA.
Per garantir que tothom tingui una comprensió constant dels conceptes clau, aquí teniu algunes explicacions de terme:
- Amplificació de la polimerasa recombinasa (RPA): es tracta d’una tecnologia d’amplificació mediada per la recombinasa.
-Amplificació assistida per recombinasa (RAA): un mètode d'amplificació similar a la recombinasa.
- Amplificació isotèrmica mediada per bucle (LAMP): una altra tècnica d’amplificació isotèrmica.
- Amplificació ràpida isotèrmica multienzima (MIRA): una nova tecnologia d’amplificació ràpida isotèrmica.
Resum i aclariment ràpid:
Molts es podrien preguntar quins d'aquests diversos mètodes d'amplificació isotèrmica són més fiables i estables. En realitat, cada tecnologia té els seus punts forts i limitacions. Tanmateix, els factors clau per a l’adopció amb èxit són la capacitat d’escalar la producció de forma fiable, de baix cost i rendiment robust en aplicacions diverses.
Ara analitzaré breument cada tecnologia en funció del que sé:
Làmpada (amplificació isotèrmica mediada per bucle):
Molts del camp saben que la làmpada es va originar al Japó, desenvolupada pel doctor Notomi el 2000 com a nova tècnica d’amplificació gènica. Actualment, la propietat d’aquesta tecnologia pertany a l’empresa japonesa Eiken Chemical Co., Ltd.
Avantatges:
- Alta sensibilitat (2-5 Ordres de magnitud superiors als mètodes de PCR tradicionals).
- Temps de reacció curt (les reaccions es poden completar a 30-60 minuts).
- No hi ha necessitat d’instruments especials en ús clínic (tot i que es recomana un turbidímetre en temps real durant el desenvolupament del kit).
- Fàcil d’operar (ja sigui detectant ADN o ARN, el procés consisteix en barrejar la solució de reacció, els enzims i la plantilla en un tub de reacció, després incubar a uns 63 graus durant 30-60 minuts en un bany d’aigua o incubadora, amb resultats observables per l’ull nu).
Desavantatges:
- L’alta sensibilitat pot donar lloc a la contaminació per aerosol un cop obert el tub, cosa que fa que no sigui apte per a l’ús fora d’un laboratori PCR a causa d’un alt risc de falsos positius.
- El disseny d’imprimació és difícil, fent que no sigui adequat per a algunes malalties, especialment les causades per virus amb poques seqüències comunes.
- La seva aplicació és relativament limitada.
Tecnologies d’amplificació isotèrmica RPA i RAA:
Aquests dos mètodes són en gran mesura homòlegs, sent la diferència principal la font de la recombinasa utilitzada.
- La recombinasa de RPA prové del bacteriòfag T4.
- La recombinasa de RAA deriva de bacteris o fongs.
Punts clau del principi de treball:
1. En presència d’ATP, la recombinasa s’uneix a imprimadors, formant un complex d’àcid proteïna-nucleic, que després busca l’ADN objectiu que coincideixi.
2. Una vegada que l’imprimació troba la plantilla d’ADN que coincideix, la hidròlisi ATP proporciona l’energia per a la recombinasa per deixar l’imprimació i l’ADN polimerasa sintetitza una nova cadena d’ADN.
3. Al mateix temps, les proteïnes que uneixen ADN (SSB) d’unes cadenes s’uneixen a la cadena d’ADN desplaçada per evitar la reforma de la doble cadena.
Avantatges:
- La reacció RPA/RAA és molt ràpida, amb resultats assolits en uns 30 minuts.
- La sensibilitat pot arribar a 10 exemplars/μl.
- No hi ha necessitat d’equips complexos durant l’amplificació.
-El desenvolupament addicional de mètodes de cromatografia d'or basats en sondes o col·loïdals simplifica molt la interpretació de resultats, cosa que els fa molt adequats per a l'ús en àrees de recursos limitades o desfavorides econòmicament.
Desavantatges:
- RPA és una tecnologia desenvolupada per l’empresa britànica TwistDX, que ara és propietat d’Abbott, donant lloc a costos elevats, cicles de subministrament llargs i falta de suport tècnic. Això dificulta l’aplicació a gran escala i la producció massiva a la Xina.
- RAA és una tecnologia purament domèstica, però no té estabilitat en termes de resistència a la interferència i consistència del reactiu del producte. A més, el procés de fabricació dels enzims funcionals necessita millorar. Tot i que la tecnologia ha estat al mercat durant cinc anys, encara no s’ha adoptat àmpliament a causa de l’estabilitat i la versatilitat.
- Tant RPA com RAA requereixen imprimadors que tinguin 30-35 bp de longitud. Els primers primers més curts afecten l’especificitat, la sensibilitat i la velocitat d’amplificació, cosa que fa que el disseny d’imprimació sigui difícil.
MIRA (amplificació ràpida isotèrmica multienzima):
Mira és una nova tecnologia d’amplificació isotèrmica introduïda a Mid -2019. És homòleg a RPA i RAA.
Tot i que MIRA comparteix similituds amb RPA i RAA en termes de principis de treball, hi ha diferències significatives en la selecció dels enzims, el cultiu, la purificació i altres aspectes de la producció a gran escala. A més, l’equip tècnic del desenvolupador de Mira, Ampfuture, porta gairebé 11 anys perfeccionant la tecnologia. Ara està totalment equipat per donar suport al desenvolupament de reactius preparats per utilitzar, desenvolupament personalitzat, projectes de recerca i altres serveis personalitzables.
Avantatges:
1. Les proteïnes funcionals dels reactius MIRA provenen de diversos enzims, amb alguns enzims sotmesos a modificacions dirigides per millorar l'eficiència del sistema enzimàtic central, donant lloc a un sistema més complet.
2. Resistència i estabilitat de la interferència fortes. Els reactius MIRA es sotmeten a una àmplia optimització en termes de selecció i concentració del cofactor, juntament amb els processos de producció assecat al congelat, fent-los més resistents a la interferència i més estables.
3. Personalització i versatilitat. A causa del control complet sobre la producció de proteïnes funcionals i una comprensió profunda de la tecnologia, MIRA es pot adaptar a diverses aplicacions, oferint diferents sistemes de reactius i serveis personalitzats de personalització.
4. Patents propietàries. Com que MIRA està desenvolupada 100% nacional, no hi ha risc d’infracció de patents durant el desenvolupament de productes. Això proporciona a Mira un avantatge competitiu tant als mercats nacionals com internacionals.
5. S'ha establert un protocol de producció complet, que permet una producció estable a gran escala.
Desavantatges:
1. El reconeixement del mercat continua sent baix, i es necessiten més dades i referències de diferents camps (com ara taxes positives en diferents àrees) per obtenir una acceptació més àmplia.
2. El disseny d’imprimació segueix encara les característiques de RPA o RAA, que requereixen seqüències d’imprimació o sonda més llargues, cosa que pot no facilitar un interruptor ràpid per als usuaris actuals de PCR.