En el camp del diagnòstic molecular, la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) s'ha considerat durant molt de temps com l'estàndard d'or per a la detecció d'àcids nucleics. En els darrers anys, les tecnologies d'amplificació isotèrmica, representades per l'amplificació de la polimerasa recombinasa (RPA), han guanyat una atenció creixent a causa de la seva velocitat, senzillesa i adequació per fer proves al lloc-.
Tot i que tant la PCR com la RPA són mètodes d'amplificació d'àcids nucleics, difereixen significativament en principis de treball, requisits d'equip i escenaris d'aplicació, fent que cada tecnologia sigui adequada per a diferents necessitats de diagnòstic.
1. Principis bàsics: cicle tèrmic vs. amplificació de temperatura constant-
La PCR és un procés bioquímic capaç d'amplificar una sola molècula d'ADN en milions de còpies en un curt període de temps. La reacció es basa en cicles tèrmics repetits i consta de tres passos principals:
1.Desnaturalització (90-95 graus): l'ADN de doble -cadena es separa en cadenes simples.
2.Recuit (55-65 graus) - Els cebadors s'uneixen a les seqüències diana.
3.Extensió (72 graus): l'ADN polimerasa sintetitza noves cadenes d'ADN.
Mitjançant aquests cicles{0}}controlats de temperatura, l'ADN objectiu s'amplifica de manera exponencial amb alta precisió. Tanmateix, la PCR requereix instruments de cicle tèrmic complexos i normalment triga entre 1 i 2 hores a completar-se.
En canvi, RPA funciona a una temperatura constant de 37-42 graus, permetent una ràpida amplificació de l'àcid nucleic sense cicles tèrmics. La tecnologia es basa en l'acció coordinada de proteïnes recombinases, proteïnes d'unió a l'ADN-monocatenari-i l'ADN polimerasa-que desplaça la cadena per aconseguir una amplificació diana molt específica en condicions isotèrmiques.
L'ADN polimerasa utilitzada en RPA té activitat de desplaçament de cadena però no té activitat exonucleasa 5'→3'. Durant l'amplificació, els cebadors exteriors s'estenen al llarg de la cadena de plantilla. Quan es troben amb regions de doble-cadena sintetitzades a partir d'encebadors interns, la polimerasa no pot degradar la cadena aigües avall i, en canvi, la desplaça, generant nous productes d'amplificació.
Tota la reacció es completa a temperatura constant, eliminant la necessitat d'una instrumentació complexa i permetent una veritable prova-de-atenció i de camp-. Mitjançant la incorporació de la transcriptasa inversa, RPA també es pot aplicar a la detecció de diana d'ARN.
Els resultats de l'amplificació es poden analitzar mitjançant diversos formats de lectura, com ara la detecció de punts finals, el monitoratge de fluorescència-en temps real, assajos de flux lateral i es poden integrar encara més amb sistemes CRISPR-Cas, microfluídica o seqüenciació de propera-generació (NGS) per al desenvolupament d'assaigs avançats.
Escenaris d'aplicació: precisió de laboratori i proves ràpides al lloc-
La PCR s'ha convertit en una de les tecnologies de diagnòstic molecular més valuoses i segueix sent l'estàndard d'or per a les proves d'àcids nucleics.
Gràcies a la seva alta precisió, rendibilitat i escalabilitat, la PCR s'utilitza àmpliament en diagnòstics clínics, laboratoris centralitzats, institucions d'investigació i programes de detecció a gran-escala, on la infraestructura i el personal format estan fàcilment disponibles.
D'altra banda, l'RPA ofereix avantatges clars en el diagnòstic ràpid del lloc{0}. Amb l'amplificació completada en tan sols 20 minuts, requisits mínims d'equip i un funcionament senzill, RPA és ideal per a.
- Atenció primària i entorns d'emergència
- Inspecció de duanes i fronteres
- Examen de camp de malalties animals i vegetals
- Proves ambientals i de seguretat alimentària
Quan es combina amb dispositius portàtils i tires de flux lateral, RPA permet proves moleculars ràpides i fiables fora dels laboratoris tradicionals.
MIRA (amplificació ràpida isotèrmica multienzima)és la tecnologia d'amplificació isotèrmica patentada d'Amp Future. Pertany a la mateixa família tècnica que RPA i s'inspira en mecanismes naturals de recombinació i reparació d'ADN, utilitzant múltiples enzims funcionals per aconseguir una ràpida amplificació de l'àcid nucleic a temperatura constant.
MIRA utilitza un sistema coordinat de cinc enzims clau, que inclou l'helicasa, la recombinasa, la proteïna d'unió a l'ADN-monocatenari- i l'ADN polimerasa, per permetre:
- Ampli rang de temperatura de funcionament: 25 graus -45 graus
- Amplificació ràpida: resultats en 20 minuts
- Alta sensibilitat i especificitat
- Seguretat millorada i risc de contaminació reduït
MIRA és una tecnologia d'amplificació d'àcids nucleics dissenyada específicament per fer proves reals al-lloc i-punt de-atenció.
A partir de la plataforma MIRA, Amp Future ha desenvolupat una cartera completa de productes per a POCT molecular ràpid, que inclou:
Agent d'alliberament ràpid d'àcids nucleics:
L'àcid nucleic amplificable s'obté en 5 minuts a temperatura ambient; baixa inhibició, que permet una càrrega completa de la mostra de fins a 50 μL; transport i emmagatzematge a temperatura ambient, no requereix protecció contra la llum.
Reactiu d'amplificació d'àcid nucleic isotèrmic:
Amplificació completada en 5-20 minuts, ràpida i eficient; diverses formes de reactius (pols liofilitzada, microesferes liofilitzades, etc.); diversos mètodes de presentació de resultats (electroforesi, fluorescència, tires reactivas).
Dispositius portàtils miniaturitzats:
Detectors isotèrmics digitals, eines de prova de mida-de butxaca, fàcils de subjectar amb una mà, equipades amb un banc d'energia, que us alliberen de les limitacions del laboratori i us permeten proves d'àcids nucleics precises al camp.
Tires de prova simples/múltiples:
Optimitzat basat en la metodologia MIRA per a una millor compatibilitat; combinat amb la tecnologia MIRA, destacant la comoditat.
Analitzador d'amplificació d'àcids nucleics totalment automatitzat:
Només requereix una operació de càrrega de mostres per a una detecció totalment automatitzada; límit de detecció fins a una còpia única; L'amplificació isotèrmica i el tapatge automàtic redueixen el risc de contaminació.
A-Paquet de proves ràpides del lloc:
Proves-in situ-, en qualsevol moment i en qualsevol lloc, tot en un sol paquet; completa la prova en 30 minuts, precisa i sensible.
Per obtenir més informació sobre productes o solucions, no dubteu a contactar amb nosaltres.