Aeromonas hydrophila és un bacteri patògen important en l'aqüicultura, que causa greus malalties en animals de granja i provoca pèrdues econòmiques importants. Per permetre una detecció ràpida-in situ, hem desenvolupat una plataforma microfluídica portàtil que integra l'amplificació ràpida isotèrmica multi-enzim (MIRA) amb la manipulació automatitzada de fluids. El disseny del xip incorporava un motor de vibració en miniatura i coixinets de calefacció de ceràmica per mantenir
control precís de la temperatura i garantir l'homogeneïtat de la reacció durant l'extracció i l'amplificació d'àcids nucleics. Una bomba d'aire en miniatura va conduir l'extracte d'ADN brut a través del xip en un sol pas de pipeta per a una precisióquantificació. L'ADN extret es va transferir posteriorment a una cambra de reacció precarregada amb MIRAreactius per a l'amplificació isotèrmica a 39 graus sota monitorització de fluorescència-en temps real. Aquesta plataforma detectada
A. hydrophila en mostres d'aigua en 40 minuts, aconseguint un rang lineal d'1 × 10² a 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1i un límit de detecció (LOD) de 10 CFU⋅mL−1. En particular, el seu disseny modular permet un fàcil intercanvi d'encebadors i sondes, fent que la plataforma sigui fàcilment adaptable per detectar diversos patògens bacterians a l'aqüicultura.
Comparació esquemàtica de la plataforma microfluídica portàtil i la plataforma de detecció convencional d'A. hydrophila. (A) El microfluídic portàtil
plataforma. El flux de treball de detecció d'aquesta plataforma integra l'extracció d'àcids nucleics, el pipet precís, l'amplificació i la detecció. (B) La plataforma de detecció convencional. El flux de treball convencional-basat en laboratori es basa en equips sofisticats, personal format i procediments-intensius en temps.
Avaluació de l'estabilitat de la plataforma microfluídica portàtil. (A) Fotografia de la plataforma microfluídica portàtil. (B, C) Rendiment tèrmic de les cambres d'extracció i detecció d'àcids nucleics. Relació entre el coixinet de calefacció de ceràmica i la temperatura de la cambra. (D) Estabilitat de detecció de fluorescència (N=3). La intensitat de la fluorescència es va mesurar a intervals de 5 minuts durant tot el procés d'amplificació.
Avaluació del rendiment de la plataforma microfluídica portàtil. (A) Corba de calibratge per a la detecció d'A. hydrophila (N=3). Es va establir una corba de calibratge detectant A. hydrophila en un rang de concentració d'1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1en condicions òptimes. (B) Avaluació de la reproductibilitat de xip-a-. L'assaig MIRA per a A. hydrophila es va realitzar en deu fitxes fabricades a partir de cadascun dels dos motlles independents. (C) Anàlisi d'especificitat (N=3). L'especificitat de l'assaig MIRA es va validar contra l'A. hydrophila objectiu i 11 espècies bacterianes no -objectiu. (D) Comparació amb qPCR (N=3). Tant la plataforma com la qPCR es van utilitzar per detectar A. hydrophila a diverses concentracions. (E) Detecció de soques aïllades de camp- (N=3). Es van detectar quatre soques-aïllades de camp d'A. hydrophila utilitzant tant la plataforma com la qPCR.