L’article proposa una nova tecnologia de xip microfluídica per a la detecció de multiplex de microorganismes patògens de gambes. L’equip d’investigació va integrar la tecnologia d’amplificació d’àcids nucleics ràpids isotèrmics (MIRA) multi-enzimàtics i mètodes de detecció de fluorescència en temps real. Aquest xip microfluídic proporciona una solució ràpida, sensible i eficient per a la detecció in situ de patògens de gambes principals.
Antecedents i significació de la investigació
La indústria agrícola mundial de gambes és un dels components econòmics més importants de l’aqüicultura, però la indústria s’ha enfrontat des de fa temps a amenaces de diverses microorganismes patògens. Aquests patògens sovint condueixen a la mort a gran escala de gambes, afectant greument la producció i els beneficis econòmics. Incloent la malaltia necrosi hepatopancreàtica aguda (AHPND), virus de la síndrome de taques blanques (WSSV), virus hipodèrmic i hematopoietic de virus (IHHNV), hemocits de gambes iridovirus (shiv), i enterohepaticus (EHP), etc. virus, bacteri i paràsits Pose Pose Pose Pose Pose Pose Pose Madenes a la shragp.
Els mètodes tradicionals de detecció de patògens, com la reacció en cadena de la polimerasa (tecnologia PCR), tenen alta sensibilitat i especificitat, però són complexos per operar, trigar molt i confiar en equips de laboratori. Aquestes limitacions fan que la tecnologia PCR sigui inadequada per a proves ràpides in situ. La tecnologia MIRA s’ha convertit en una eina de detecció molecular adequada per a l’aplicació in situ a causa de les seves característiques d’amplificació ràpida a temperatura constant i temperatura normal.
Principi de Mira Technology
La tecnologia d’amplificació d’àcids nucleics ràpid de temperatura constant multi-enzim (MIRA Technology) és una tecnologia d’amplificació de temperatura constant que es basa en la sinergia de múltiples proteïnes funcionals a temperatura ambient per aconseguir una ràpida amplificació d’àcids nucleics. Es tracta d’una tecnologia de detecció d’àcids nucleics ràpid realment portàtil. En comparació amb la PCR, Mira té més avantatges.
Disseny i innovació de xips microfluídics
Diagrama esquemàtic de la plataforma de detecció de RPA en xip per a diversos microorganismes patògens de gambes importants
(A) Estructura d'un xip microfluídic tipus disc. 1: Cambra de reacció; 2: vàlvula de bola; 3: port d’escapament; 4: Port de mostreig;
(B) Vista explotada. 5: pel·lícula de segellat de calor; 6: Substrat de xip.
(C) Disposició detallada dels sis conjunts de imprimadors dins del sector. Cada conjunt d’imprimació es fixa en una cambra de reacció designada.
(D) Procediment de funcionament complet Plataforma de detecció de RPA en xip.
L’article proposa un xip microfluídic integrat amb la tecnologia MIRA per a la detecció de multiplex de microorganismes patògens de gambes. La tecnologia microfluídica pot controlar els líquids dins dels canals a nivell de micres per a una manipulació precisa, aconseguint així la detecció eficient i de baix cost de diversos costos.
El xip té les següents funcions de disseny de claus:
● Xip microfluídic centrífuga
El xip adopta un disseny de la unitat centrífuga, que utilitza la força centrífuga per distribuir la mostra uniformement a cada cambra de reacció. Aquest disseny simplifica el procés de funcionament i l'operador pot completar tota la reacció simplement injectant la mostra.
● Detecció de diversos objectius
El xip està pre-incrustat amb els tipus bacterians que cal detectar: necrosi hepatopancreàtica aguda (V-AHPND), virus de la síndrome de taques blanques (WSSV), virus infecciós de necrosi subcutània (IHHNV), hemocits de gambes iridovirus (Shiv) i Enterohepatitis hepatica (EHP). ) Sondes d’imprimació per a cinc patògens. Aquest disseny pot detectar simultàniament sis objectius gènics en una reacció, permetent un cribratge ràpid de múltiples patògens.
● Detecció de fluorescència en temps real
La reacció d’amplificació de la tecnologia MIRA al xip es combina amb una sonda fluorescent, que pot controlar el progrés de la reacció d’amplificació en temps real. El disseny de la sonda permet alliberar el senyal fluorescent només quan es genera el producte d’amplificació, aconseguint així la detecció quantitativa ràpida i sensible.
● Sistema de reacció de baixa concentració
Cada unitat de reacció del xip només requereix un volum de reacció de 5 µl, cosa que redueix considerablement el consum de reactius. Quan tot el sistema funciona, es poden processar fins a quatre mostres simultàniament i cada mostra pot detectar cinc patògens, millorant molt l’eficiència de detecció.
Sensibilitat, especificitat i repetibilitat
El rendiment del sistema de xip inclou la detecció de simetria, ressonància i repetibilitat.
● Sensibilitat
Els resultats experimentals mostren que el xip pot detectar números de còpia del gen objectiu fins a 10 còpies/μL, amb sensibilitat comparable o fins i tot superior als mètodes de PCR tradicionals. Aquesta alta sensibilitat garanteix que la tecnologia pot detectar individus infectats primerencs en aplicacions pràctiques, permetent així el cribratge precoç dels patògens.
● Especificitat
L’experiment va realitzar proves de reacció creuada en diversos patògens no objectius i els resultats van demostrar que el xip és altament específic per als patògens objectiu i pot distingir amb precisió diversos tipus de patògens. Totes les proves per a la malaltia necrosi hepatopancreàtica aguda (V-AHPND), virus de la síndrome de taques blanques (WSSV), virus de necrosi hipodèrmic i hematopoietic (IHHNV) de shrimp Hemacyscence virus (shiv) i enterohepatitis hepaticera (EHP). pot evitar eficaçment l'amplificació no específica.
● Repetibilitat
Per avaluar l'estabilitat del mètode, l'equip de recerca va realitzar múltiples experiments repetits. Els resultats van mostrar que el coeficient de variació (valor CV) entre diferents experiments va ser inferior al 10%, mostrant una bona repetibilitat i consistència experimentals.
Aplicacions i avantatges de camp
El disseny del xip microfluídic de la tecnologia MIRA proporciona avantatges significatius d’aplicació de camp, especialment adequats per a la detecció i el seguiment ràpid de patògens en l’agricultura de gambes:
● Procés de funcionament convenient
Tot el procés de detecció només requereix injectar la mostra al xip i iniciar el dispositiu de reacció. No requereix gairebé cap operació manual i és adequat per a que els no professionals puguin utilitzar al lloc.
● Capacitat de resposta ràpida
El sistema pot obtenir resultats de proves en 20 minuts, reduint molt el temps de prova. Això és crucial per a la resposta ràpida a les malalties a les granges i la reducció de la propagació de patògens.
● Capacitat de detecció de multiplex
Es poden identificar cinc patògens principals en una prova, que millora considerablement l'eficiència de detecció i estalvia els costos i el temps de detecció.
Perspectives de tecnologia Mira
Tot i que la tecnologia PCR ha estat classificada durant molt de temps com a estàndard d'or per a la detecció d'amplificació d'àcids nucleics, la tecnologia MIRA ha demostrat un gran potencial d'aplicació a causa de la seva ràpida reacció a temperatura constant, funcionament senzill i requisits baixos d'equips. Si es compara amb la PCR combinada amb la seqüenciació d’ADN, es va trobar que els resultats de detecció del xip d’amplificació isotèrmica són consistents amb els resultats de PCR en termes de sensibilitat i especificitat i que el temps de reacció de la tecnologia MIRA s’escurça significativament. Per tant, es considera que els xips microfluídics de la tecnologia MIRA són una tecnologia més adequada per a aplicacions de camp, especialment en entorns que requereixen detecció de patogen ràpid i a gran escala.
Els xips microfluídics basats en la tecnologia d’amplificació d’àcids nucleics ràpids isotèrmics (MIRA) multi-enzimàtics proporcionen una eina eficaç per a la detecció de microorganismes patògens en l’agricultura de gambes. Aquesta tecnologia té els avantatges d’alta sensibilitat, bona especificitat, fàcil funcionament i velocitat de detecció ràpida i té àmplies perspectives d’aplicació en la prevenció i el control de la malaltia de l’aqüicultura. Amb un major desenvolupament i optimització de la tecnologia, s'espera que el sistema s'apliqui a la detecció de patògens més aquàtics, permetent la prevenció i el seguiment de malalties més àmplies.
Els resultats de la investigació proporcionen un mètode de detecció precoç fiable per a la indústria de l’aqüicultura, que pot reduir eficaçment el risc de brots de malalties, millorar l’eficiència de producció i la producció de les granges i establir un fonament tècnic per al desenvolupament sostenible de la indústria aqüícola.