《Desenvolupament d’una nova CAS13A/CAS12A mediada"One-pot" dual assaig de detecció de cultius modificats genèticament
Els cultius modificats genèticament s’han plantat àmpliament a tot el món i molts països han millorat gradualment les seves mesures reguladores per garantir la seguretat dels cultius modificats genèticament. El desenvolupament de mètodes de detecció genètica ràpida i precisa és molt important per a l’agricultura i la bioseguretat i pot alleujar les preocupacions públiques sobre productes modificats genèticament.
En aquest estudi, el grup de recerca va desenvolupar una nova reacció One-Pot -- MIRA Detecció Dual combinada amb Dual CRISPR (mètode MR-DCA) per a la detecció simultània de objectius genètics CAMV35S i NOS en cultius modificats genèticament, proporcionant un mètode de detecció senzill i eficient per a la detecció de crops modificats genèticament.
Mètodes experimentals
El producte Mira dual és analitzat per CAS13A i CAS12A Dual System per generar dos senyals independents que no interfereixen entre ells, i després el color fluorescent és llegit per un instrument d’il·luminació o per una tira de prova amb dues línies T per aconseguir una lectura de doble canal. Tot el procés es completa en menys de 35 minuts, amb un límit de detecció fins a 20 exemplars.
(Principi de detecció de MR-DCA de CAMV35S i NOS)
L’experiment sencer es divideix en tres passos: l’amplificació de Mira, la reacció CRISPR i dos mètodes d’interpretació de resultats.
El gen CAMV35S s'utilitza com a objectiu de CAS13A, i el gen NOS s'utilitza com a objectiu de CAS12A. Es van dissenyar respectivament dues parelles de primers Mira. El sistema CAS13A només reconeix l’ARN, de manera que està dissenyada la regió d’imprimació endavant, que conté un promotor T7 per a la posterior transcripció i l’activació de CAS13A. S’afegeix un PAM al gen NOS. Les addicions anteriors garanteixen que tant les proteïnes CAS13A com CAS12A poden unir-se als seus respectius CRRNAs, i no hi ha interferències ni reacció creuada entre els dos sistemes.
Situació experimental
Sensibilitat i especificitat
La mostra es va diluir en un gradient per provar la intensitat de fluorescència de la reacció MIRA. Es va trobar que encara es podia detectar la intensitat de fluorescència a una concentració de mostra de 20 µl. La concentració de 20 µl es va seleccionar finalment per a l'experiment.
(S'utilitzen diferents concentracions de mostra i tires de prova per al desenvolupament de colors i el càlcul de quantificació d'intensitat)
Per avaluar encara més l'especificitat de MR-DCA, l'equip de recerca va provar mostres mixtes d'animals no transgènics i plantes no transgèniques. Els resultats van mostrar que només mostres transgèniques que contenien CamV35S i NOS tenien senyals de fluorescència altes, mentre que la intensitat de fluorescència d'altres mostres era propera a la del control negatiu. MR-DCA es pot utilitzar com a plataforma específica de detecció d’àcids nucleics de doble objectiu.
MR-DCA van provar 24 mostres de cultiu. Entre ells, 1, 2, 15, 16, 21 i 22 són blat de moro transgènic que conté promotor CAMV35S. 7, 8, 23 i 24 són arròs transgènic resistent a la malaltia que conté el terminador NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 i 18 són soja transgènica que conté CamV35S Promotor i Terminator Nos.
(Resultats de les proves de 24 mostres)
Reacció ràpida
El temps de reacció és un factor important en la detecció in situ. L’equip d’investigació va observar que els senyals de fluorescència de FAM i HEX es podien detectar mitjançant un instrument de fluorescència quan el temps de reacció va ser de 10 minuts. Mira combinada amb la reacció CRISPR també va observar la fluorescència groga al cap de 15 minuts.
(Senyal de fluorescència en diferents temps de reacció de Mira)
(El desenvolupament del color de les tires de prova a diferents temps de reacció MIRA i el càlcul de quantificació d’intensitat)
Conclusió experimental
Els resultats experimentals van demostrar que la MIRA dual té una bona especificitat i pot obtenir amb precisió els productes d’amplificació de CAMV35S i NOS. Els sistemes CAS13A i CAS12A reaccionen de manera independent sense interferir entre ells. La prova MR-DCA pot detectar amb precisió 20 còpies a una temperatura baixa de 35 minuts, cosa que té un gran valor en la detecció de cultius modificats genèticament al camp.
Informació de l'article
Nom de la revista: 《Journal of Advanced Research Express
Títol de l'article: 《Desenvolupament d'una novel·la de detecció "One-Pot" mediada per CAS13A/CAS12A per a cultius modificats genèticament
Factor d’impacte: 11.4
Equip de recerca: Wang Xiaofu, l'Acadèmia de Ciències Agrícoles de Zhejiang