Grass SHRIMP és una espècie econòmica important a la indústria de l'aqüicultura d'aigua dolça de la Xina. No obstant això, en els darrers anys, elMicrosporidium hepatopancreàtic(EHP), un paràsit que infecta l’hepatopancreas de les gambes, ha afectat greument la indústria. Com que actualment no hi ha cap medicament o vacuna eficaç per tractar aquesta malaltia, la detecció ràpida i precisa és crucial per evitar la seva propagació.
A.Magnified 9. 0 × 1 0 3 vegades; B. Magnificat 5,0 × 104 vegades.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Aïllament i observació morfològica del microsporidium hepatopancreàtic a Litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.J.1118.2018.17430.
La detecció d’EHP es basa principalment en mètodes de biologia molecular, sent la tecnologia PCR la més comuna. Tot i això, mentre que la PCR ofereix una alta sensibilitat, requereix equips de PCR costosos i un entorn de laboratori especialitzat, cosa que el fa inadequat per a l’ús de camp. Per solucionar aquest problema, l’equip de recerca va desenvolupar dos mètodes de detecció ràpids basats en la tecnologia MIRA. Aquests mètodes ofereixen una alta sensibilitat, una resposta ràpida i un funcionament fàcil, permetent una detecció eficient i ràpida d’EHP en el lloc de gambes sense necessitat d’equips de laboratori complexos, omplint així el buit en els mètodes de detecció actuals.
Els reactius d'amplificació utilitzats en l'estudi:
- Kit d'amplificació ràpida isotèrmica de l'ADN (bàsic)
- Kit d'amplificació ràpida isotèrmica de l'ADN (tipus de tira d'or col·loïdal)
La tecnologia Mira és un mètode d’amplificació d’àcids nucleics ràpid isotèrmic multigur. El seu principi bàsic consisteix en l’acció coordinada de múltiples proteïnes funcionals a temperatures ambientals per aconseguir una ràpida amplificació d’àcids nucleics, permetent la detecció d’àcids nucleics realment portàtil.
Mètodes de recerca
Extracció de mostra
L’equip d’investigació va recollir mostres de gambes d’herba infectades i saludables de tres granges de gambes a la província de Liaoning, extreure l’ADN de l’hepatopancreas de les gambes.
Disseny d’imprimació
Es van dissenyar tres conjunts de primers MIRA dirigits al gen de proteïna serina S8 de EHP (número d’adhesió de GenBank: el 182063). Aquest gen té llocs actius únics, garantint l’especificitat de la detecció.
Detecció de Mira-Age i Mira-LFD
(A) Temperatures de reacció de l'edat RPA optimitzades. M: marcador DL 500; N: Control negatiu; Soques 1-5: 25 graus, 30 graus, 37 graus, 39 graus i 42 graus.
(B) Temps de reacció de l'edat RPA optimitzats. M: marcador DL 500; N: Control negatiu; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) Temperatures de reacció RPA-LFD optimitzades. N: Control negatiu; 1: 25 graus; 2: 30 graus; 3: 37 graus; 4: 39 graus; 5: 42 graus.
(D) Temps de reacció RPA-LFD optimitzats. N: Control negatiu; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
Es van utilitzar els dos mètodes de detecció de Mira, Mira-Age (electroforesi en gel d'agarosa) i Mira-LFD (immunoassaig de flux lateral d'or col·loïdal) per detectar EHP. L’equip de recerca va optimitzar les temperatures i els temps de reacció mitjançant l’experimentació. MIRA-AGE va amplificar l'ADN objectiu en 30 minuts a 37 graus, mentre que Mira-LFD va completar l'amplificació en només 10 minuts a 37 graus, amb resultats llegibles en 5 minuts.
Resultats experimentals
Especificitat i sensibilitat
(A) Especificitat de la detecció de l'edat RPA. M: marcador DL 1000; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: encefalitozoon; 3: Microsporidia; 4: virus de la síndrome de punt blanc; 6: Anormal; N: Control negatiu.
(B) Especificitat de la detecció de RPA-LFD. P: Nosema Bombycis; N: Control negatiu; 1: EHP; 2: encefalitozoon; 3: Microsporidia; 4: virus de la síndrome de punt blanc; 6: Anormal.
(C) Sensibilitat de l'edat RPA amb dilucions de gradient de plasmids recombinants. M: marcador DL 500; N: Control negatiu; 1: 4,7 × 10^5 còpies/µl; 2: 4,7 × 10^4 còpies/µl; 3: 4,7 × 10^3 còpies/µl; 4: 4,7 × 10^2 còpies/µl; 5: 4,7 còpies/µl; 6: 4.7 Còpies/µl.
(D) Sensibilitat de RPA-LFD amb dilucions de gradient de plasmids recombinants. N: Control negatiu; 1: 4,7 × 10^5 còpies/µl; 2: 4,7 × 10^4 còpies/µl; 3: 4,7 × 10^3 còpies/µl; 4: 4,7 × 10^2 còpies/µl; 5: 4,7 còpies/µl; i 6: 4,7 còpies/µl.
Els experiments van demostrar que la tecnologia MIRA té alta especificitat, detectant amb precisió EHP sense reaccionar a altres patògens. En termes de sensibilitat, ambdós mètodes tenien un límit de detecció de 4,7 còpies/µL, significativament superior a la sensibilitat de la PCR tradicional.
Prova de mostra clínica
Els resultats de la prova de 30 mostres clíniques van demostrar que MIRA-AGE i MIRA-LFD tenien una taxa de positivitat del 70%, lleugerament inferior al 80%de QPCR, però significativament superior al 56,7%del PCR tradicional.
Perspectives d'aplicació
Els mètodes de detecció basats en MIRA permeten una ràpida amplificació dels gens objectiu a temperatures constants. En particular, el mètode Mira-LFD pot proporcionar resultats en només 10 minuts sense necessitat d’equips de laboratori complexos, cosa que el fa ideal per a l’ús in situ a les granges de gambes. L’elevada sensibilitat i l’especificitat d’aquesta tecnologia la converteixen en una eina eficient per a la detecció i el control precoç d’EHP, protegint així la salut i el desenvolupament de la indústria agrícola de gambes herbes.
Entre aquests mètodes, el immunoassaig de flux lateral d'or col·loidal (MIRA-LFD) és especialment adequat per a aplicacions in situ per la seva senzillesa i resultats intuïtius. Els agricultors de gambes herbes poden detectar i respondre a les infeccions de la EHP ràpidament, millorant les capacitats de control de la malaltia, augmentant significativament l’eficiència agrícola i reduint les pèrdues econòmiques.